细胞培养要求：细胞培养环境应保持在气相95%空气和5%二氧化碳的条件下，温度维持在37℃。所使用的培养基为F12K，并添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素-链霉素（P/S）。

细胞系介绍：该细胞系由DJGriad通过肺癌组织移植建立。患者为58岁白人男性。A549细胞能够通过胞苷二磷酸胆碱途径合成含有高含量不饱和脂肪酸的卵磷脂。

传代方法：在首次传代时，建议比例为1:2。如果细胞生长达到80%汇合度，可以进行传代；如果未达到80%汇合度，则需将培养液收集至离心管中，并保留约5ml的完全培养基在37℃、5% CO2环境中培养。

细胞处理操作：收到细胞后，首先用75%酒精喷洒细胞瓶的外表进行消毒，随后放置于超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱静置3至4小时，以稳定细胞状态。使用显微镜观察细胞生长情况并拍摄不同倍数的照片（建议40x, 100x, 200x各一张）。前三天的生长照片可作为售后依据，若不提供照片，则默认收到的细胞状态良好。

对于细胞的再处理，应在培养至良好状态后用完整培养液灌满并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。

细胞传代的步骤如下：

• 首先弃去培养上清液，使用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
• 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，放置在37℃培养箱中消化1-2分钟，然后观察细胞消化情况，如大多数细胞已脱落，请迅速推广5ml的完全培养基终止消化。
• 轻轻吹打细胞使之完全脱落后，使用离心管收集悬液并在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液后用1-2ml完全培养基重悬细胞。
• 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（例如两个T25培养瓶），并补充5-8ml的新鲜完全培养基，最后放入37℃、5% CO2的培养箱进行继续培养。

对于悬浮细胞，可以采用半换液法，竖直放置培养瓶在培养箱中静置约1小时，轻轻吸出3ml的培养基并补充等量的新鲜完全培养基。一般情况下，可以传代3次之后，通过离心方法进行一次传代，去掉死细胞。

细胞冻存步骤：

• 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，将培养液弃去，使用PBS清洗细胞一次。
• 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，待细胞回缩变圆后加5ml完全培养基终止消化，然后轻轻吹打细胞，转移至离心管中进行离心。
• 弃去上清后，细胞重悬于雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀并加入冻存管中。
• 将冻存细胞立刻放入-80℃冰箱存放，若后期需要转入液氮罐中，则需在-80℃中存放至少24小时。

细胞复苏步骤：

• 从液氮中取出冻存管，快速置于37℃水浴中解冻，直至无结晶出现，然后用75%的酒精消毒外壁。
• 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的离心管中，并在1000RPM下离心5分钟。
• 随后弃去上清，重悬细胞并接种于T25培养瓶中，在37℃、5% CO2的条件中培养。
• 第二天更换新鲜的完全培养基，继续培养。

尊龙凯时一直致力于提供高质量的细胞培养产品与服务，确保您在细胞研究中的每一步都顺利进行。我们的细胞培养解决方案不仅高效，还兼顾您的科研需求。

注意事项：在细胞运输过程中，若发现细胞脱落情况较多，这是正常现象。可以将所有培养液收集，进行离心以去除死细胞，保证细胞的生长活力。