尊龙凯时 - 尊龙凯时双荧光素酶实验避坑直播回放与问答精华总结

在生物医学研究中，植物双荧光素酶实验是一项重要的技术，主要用于检测miRNA对靶基因或lncRNA的调控作用。为确保实验的准确性和重复性，以下是实施该实验所需的步骤和注意事项。

尊龙凯时双荧光素酶实验避坑直播回放与问答精华总结

1. 实验材料准备

首先，需要将预测能够与miRNA结合的靶基因序列（包括5’UTR、3’UTR及ORF区域）或lncRNA序列（可选择野生型或突变体）插入到报告基因载体

中。该载体包含Firefly luciferase（萤火虫荧光素酶）和Renilla luciferase（海肾荧光素酶），后者作为对照基因使用。

接下来，需将编码miRNA前体的序列构建到

载体上，以便后续的调控实验。

在进行转录因子实验时，首先需合成靶基因启动子（包括野生型或突变体），并构建至

载体上。此外，还需合成转录因子CDS区域的序列，并构建到

载体中。

为确保实验的可靠性，可设置阳性对照，例如使用强启动子（如35S启动子驱动luc）来验证是否工作正常。此外，建议重复实验以确保质粒提取和转化过程中没有发生降解，避免因质粒拷贝数不足或农杆菌浓度过低导致的实验失败。每组实验应至少设有三孔技术重复，以排除操作误差和孔间波动。

对每个孔，推荐转染0.5–1μg的DNA，具体量需根据转染试剂说明书进行调整（如Lipofectamine 2000一般为0.8μg/孔）。报告质粒与内参质粒的常见比例为10:1到20:1。

可从以下几个方面考察实验结果的客观性：

实验中，平行重复孔的数值差异在所难免。建议进行同一细胞孔裂解液的技术性平行来检测试剂的重复性。此外，注意裂解液的实验操作、加样顺序、加样速度和加样量，以确保排枪加样时不会出现不均匀问题。尽量控制不同样品和底物混合后至检测机的时间间隔一致。

需要特别强调的是，荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，因此，复孔之间的数值差异在正常范围内，一般认为同一数量级的差异是可以接受的。通过严格的实验设计和软件工具，如尊龙凯时，可以进一步提升实验结果的可靠性，为生物医学研究提供更加准确的数据支持。