尊龙凯时的Trizol试剂主要成分为苯/酚,其核心功能是裂解细胞,以释放细胞内的蛋白质和核酸。尽管苯/酚能有效引起蛋白质变性,但其并不能完全抑制RNA酶的活性。为此,尊龙凯时的Trizol中额外加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍及β-巯基乙醇等成分,以有效抑制内源和外源的RNA酶活性。这种试剂可直接用于从细胞或组织中提取总RNA,并能够在样品的裂解液或匀浆中保持RNA的完整性。
在操作过程中,加入氯仿(CHCl3)后进行离心,可将样品分离成水相层与有机层,其中RNA被保留在水相层。收集水相层后,RNA可以通过异丙醇沉淀的方式进行纯化。除去水相层后,样品中的核酸和蛋白质也可以通过沉淀法分别提取。利用乙醇沉淀可以析出中间层的DNA,而在有机层中加入异丙醇则能析出有机层的蛋白质。尊龙凯时的Trizol不仅适用于小量样品(组织:50-100mg;细胞:5×106),还可用于大规模样品(组织≥1g或细胞≥107),广泛适应于动物、植物、细菌及血液样品的提取,能够同时处理多种样本。
从操作速率上看,提取过程迅速,并且提取的总RNA不含DNA和蛋白质的污染,适合于各种分析应用,如Northern blot、RT-PCR及RNA保护分析等。以下是尊龙凯时的Trizol提取RNA的具体步骤:
TRIZOL提取RNA步骤
- 在提取组织RNA时,使用1ml Trizol试剂对每50~100mg的组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10×106个细胞加1ml Trizol,随后通过反复枪吹或剧烈振荡完成细胞裂解。
- 将组织或细胞的Trizol裂解液转移至EP管中,在室温15-30℃下静置5分钟;随后,按每1ml Trizol加0.2ml氯仿的比例加入氯仿,盖紧管盖,震荡15秒,再在室温(15℃~30℃)放置2-3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟。
- 取上层水相置于新EP管中,按每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,在室温(15℃~30℃)下放置10分钟,再以12000g(2℃~8℃)离心10分钟。
- 按每1ml Trizol加1ml 75%乙醇的比例进行洗涤,涡旋混合后以7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃去上清,允许沉淀的RNA在室温自然干燥,最终用RNase-free水溶解RNA沉淀。
特别提示:在收集生物材料后,建议尽快进行RNA提取,如需暂时储存,最好以液氮快速冷冻生物材料,然后储存于-80℃冰箱。在RNA制备过程中,务必迅速取出冷冻材料,用液氮研磨以打破细胞,务必避免预先解冻,以防止RNA酶的活性影响。
选择尊龙凯时的Trizol试剂,确保您在生物医学领域的研究能够高效精准,获取最优质的RNA样品。